А где, собственно, граница?
Как определить границу между негативной и позитивной популяцией, если на графике нет чёткого разделения между «минусом» и «плюсом»?
Когда популяции разделены хорошо, всё относительно просто. Но для маркеров активации, дифференцировки или истощения экспрессия часто распределяется непрерывно — без выраженного «провала» между отрицательной и положительной частью. В такой ситуации гейт нельзя ставить только «на глаз» — нужен ориентир.
Что обычно используют
🔸 FMO-контроль (Fluorescence Minus One)
Проба, окрашенная всеми антителами панели, кроме одного. Помогает оценить фон в нужном канале с учётом влияния остальных флуорохромов.
🔸 Изотипический контроль
Помогает оценить неспецифическое связывание антител.
🔸 Неокрашенные клетки
Позволяют оценить аутофлуоресценцию образца.
Но иногда полезный ориентир можно найти прямо в том же образце — если в нём есть популяция, для которой не характерна экспрессия нужного маркера.
Разберём на примере CD279 (PD-1)
Панель антител:
CD45 / CD3 / CD4 / CD8 / CD197 / CD45RA / CD279
На графике CD3 × CD279 нет очевидной границы между CD279− и CD279+ T-клетками.
В этом образце таким ориентиром могут быть наивные T-лимфоциты:
CD45RA+ CD197+
Для них не характерна высокая экспрессия CD279, поэтому их можно использовать как популяцию с ожидаемо низким уровнем CD279 в том же образце.
Дальше всё довольно логично: выделяем наивные T-клетки, смотрим их положение по CD279, определяем зону CD279-негативных событий и применяем эту же границу к анализируемой T-клеточной популяции.
В нашем примере доля CD279+ T-клеток составила 52,91%.
Чем удобен такой подход: он не требует окрашивания дополнительной пробы и помогает задать гейт не только по виду графика, но и с учётом ожидаемого фенотипа клеток.
Важно: если граница выглядит сомнительно, не стоит просто двигать гейт. Сначала лучше проверить панель, компенсацию, качество окрашивания и особенности самого образца.
#проточнаяцитометрия #иммунология #практикацитометрии
13
8
4May 5, 2026 170
