Разговор на клеточном уровне: post #49 — TG.ME

А где, собственно, граница? Как определить границу между негативной и позитивной популяцией, если на графике нет чёткого разделения между «минусом» и «плюсом»? Когда популяции разделены хорошо, всё относительно просто. Но для маркеров активации, дифференцировки или истощения экспрессия часто распределяется непрерывно — без выраженного «провала» между отрицательной и положительной частью. В такой ситуации гейт нельзя ставить только «на глаз» — нужен ориентир. Что обычно используют 🔸 FMO-контроль (Fluorescence Minus One) Проба, окрашенная всеми антителами панели, кроме одного. Помогает оценить фон в нужном канале с учётом влияния остальных флуорохромов. 🔸 Изотипический контроль Помогает оценить неспецифическое связывание антител. 🔸 Неокрашенные клетки Позволяют оценить аутофлуоресценцию образца. Но иногда полезный ориентир можно найти прямо в том же образце — если в нём есть популяция, для которой не характерна экспрессия нужного маркера. Разберём на примере CD279 (PD-1) Панель антител: CD45 / CD3 / CD4 / CD8 / CD197 / CD45RA / CD279 На графике CD3 × CD279 нет очевидной границы между CD279− и CD279+ T-клетками. В этом образце таким ориентиром могут быть наивные T-лимфоциты: CD45RA+ CD197+ Для них не характерна высокая экспрессия CD279, поэтому их можно использовать как популяцию с ожидаемо низким уровнем CD279 в том же образце. Дальше всё довольно логично: выделяем наивные T-клетки, смотрим их положение по CD279, определяем зону CD279-негативных событий и применяем эту же границу к анализируемой T-клеточной популяции. В нашем примере доля CD279+ T-клеток составила 52,91%. Чем удобен такой подход: он не требует окрашивания дополнительной пробы и помогает задать гейт не только по виду графика, но и с учётом ожидаемого фенотипа клеток. Важно: если граница выглядит сомнительно, не стоит просто двигать гейт. Сначала лучше проверить панель, компенсацию, качество окрашивания и особенности самого образца. #проточнаяцитометрия #иммунология #практикацитометрии